第四章 心肌梗死后抑郁大鼠心肌细胞及海马中电生理变化研究
第一节 心肌梗死后抑郁大鼠心肌细胞Bax/Bcl-2的变化及意义研究
引言
心血管疾病及抑郁均为人群高发疾病，严重影响患者生活质量并增加经济负担。心梗与抑郁为双向关系，抑郁在心梗患者中广泛而持续存在着，心梗住院患者2周内抑郁的发病率为16%~27%，其中1/2~2/3患者在出院后1~12个月抑郁仍然持续存在。抑郁严重影响心梗患者预后，一项Meta分析结果显示，心梗后抑郁患者新的心脏事件发生率是非抑郁心梗患者的1.59(95% CI，1.37~1.85)倍，且抑郁是心梗患者死亡的独立危险因子。反之，无心血管疾病的抑郁患者发生心梗的风险明显增高，多个前瞻性研究表明抑郁是心梗发生的独立预测因子，抑郁患者心梗发生率是非抑郁患者的1.64倍，且抑郁评分越高，心梗发生的风险越高。但是到目前为止，心梗与抑郁的共病机制仍不十分清楚。
细胞凋亡是由基因控制的细胞自主有序的死亡。细胞凋亡主要由Bcl-2基因蛋白家族调控，包括促凋亡基因Bax、Bak及抑制凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl。Bax以非活性形式存在于细胞质中，当受到凋亡刺激信号诱导时，发生构象改变，向线粒体转位，寡聚化，插入线粒体外膜，促进细胞色素C及凋亡诱导因子(AIF)等多种蛋白释放，最终引起细胞凋亡。Bcl-2存在于线粒体内膜、细胞膜内表面、核膜等处，生理pH条件下Bcl-2可阻止Bax在线粒体膜上形成通透性转运孔，抑制细胞色素C的释放，抑制细胞凋亡。Bax/Bcl-2值反映细胞凋亡的敏感性优于Bax或Bcl-2单个指标，值越高凋亡越活跃。
Wann等研究表明心梗后坏死组织释放多种促炎性细胞因子引起大脑边缘系统Bax/Bcl-2值增高，表明心梗可导致凋亡的发生。Wang等研究表明抑郁大鼠海马及心脏中促凋亡Bax mRNA表达增加，抑制凋亡Bcl-xl mRNA表达减少，说明抑郁同样可以导致凋亡的发生。那么心梗后抑郁大鼠，心肌Bax/Bcl-2值是否更高，凋亡是否更加活跃，凋亡是否是心梗与抑郁发生的共病机制，目前均不清楚。因此，本研究通过建立抑郁、心梗及心梗后抑郁大鼠模型，使用Western Blot检测心肌Bax/Bcl-2值，以探索凋亡是否为心梗与抑郁共病机制。
一、材料和方法
1. 材料
(1) 实验动物：清洁级(specific pathogen free，SPF)健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠(购买于武汉大学动物实验中心)，体重120~160 g。在SPF动物实验中心适应性饲养一周。
(2) 其他试剂与材料
①戊巴比妥钠 0.1 g/10 mL；培养皿2个；
②注射用青霉素钠80万U/支；小号圆针及三角针若干；
③生理盐水；非吸收性外科缝线(3-0)；
④小动物呼吸机；经纬恩线5-0；
⑤手术照明灯；碘伏；
⑥大鼠固定板(固定线或橡皮筋5根)；针管(1 mL、2 mL、10 mL)；
⑦手术洞巾(2块)；无菌纱布若干；
⑧小动物开胸器；无菌棉球若干；
⑨大号弯剪；无菌胶布手套若干；
⑩持针器；5％葡萄糖氯化钠溶液(GNS)若干；
眼科剪(直剪及弯剪各1把)；电子秤等。
手术刀1把；
2. 方法
(1) 实验分组：健康成年雄性SD大鼠，体重160~180 g，由武汉大学动物实验中心提供(雄性SD大鼠有生产许可证号)。实验室环境：饮食自由，光照时间6：00-18：00，温度(20±3) ℃，适应饲养环境一周后，将其随机分为四组：正常组(n=8)、心肌梗死组(简称心梗组)(n=12)、抑郁组(n=8)和心肌梗死后抑郁组(简称模型组)(n=15)。
(2) 模型建立
①急性心梗模型建立：大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg，麻醉后用橡皮筋将大鼠背位固定于手术台上，用皮筋将大鼠门齿固定。将大鼠四肢皮下连接心电图电极，记录心电图。将颈部备皮消毒后切开皮肤并钝性分离筋膜和肌肉，暴露气管后在第3、4气管软骨中间切开一小口，将呼吸机通气管一端插入气管约1.5 cm后固定，一端连接小型动物呼吸机(呼吸频率70次/分，潮气量10~15 mL，呼吸比1∶1)。将左前胸部皮肤备皮消毒，沿胸骨左侧纵行切开皮肤，逐层钝性分离浅筋膜、深筋膜、肌肉；使用止血钳进入第3、4肋间，并夹断第3肋、第4肋，用胸部固定器撑开肋骨，暴露心脏，使用生理盐水湿润的棉签推开心脏周围组织以充分暴露手术视野，打开心包膜，在左心耳与肺动脉圆锥之间靠下3~4 mm结扎冠状动脉左前降支，以结扎部位以下心脏变白、搏动减弱或心电图肢体导联弓背向上抬高0.2 mV为造模成功的标志。清除胸腔血液后关胸，将肋骨对合好之后缝合肌肉，最后一针时使用去针头注射器抽吸胸腔空气，缝合皮肤后消毒。使用棉签刺激大鼠舌部出现吞咽动作后可撤去呼吸机。术后三天肌注青霉素80万U预防感染。
②抑郁模型建立：抑郁组行28天慢性不可预见性温和应激刺激，具体如下：禁食24 h，禁水24 h，夹尾1 min，昼夜颠倒24 h，垫潮湿垫料24 h，禁闭2 h，倾斜鼠笼45°(24 h)。每天采取一种刺激，每种刺激平均采用4次，同种刺激不能连续采用，防止大鼠预料刺激的发生。
③心梗后抑郁模型建立：模型组大鼠按照以上急性心梗模型的制作方法建立心梗模型，待伤口恢复1周后，再按照上述方法制作抑郁模型，就建立了心梗后抑郁模型。
二、动物模型的评价
1. 大鼠心梗模型的评价
(1) 心电图检查：心梗组大鼠结扎后可以观察到与结扎前相比，心电图上ST段抬高与R波融合，表示急性心梗模型制作成功。
(2) Masson染色：将各心梗组大鼠心梗区心肌通过固定、切片、脱蜡、染色、封固等步骤进行Masson染色，最后倒置显微镜下采用DPS照相系统(SP500，日本Olympus公司)于400倍视野下拍照，正常心肌纤维红染，胶原纤维蓝染。
2. 大鼠抑郁模型的评价
(1) 糖水消耗实验：实验前在安静、隔噪的环境下训练大鼠适应饮用含糖溶液，第1个24 h内，每笼均放置两瓶1%蔗糖溶液，而在随后24 h内，放置两个瓶，一瓶装1%蔗糖溶液，一瓶装蒸馏水。在禁水禁食24 h后，进行大鼠糖水/纯水的消耗实验。在每笼上同时放置1瓶100 mL的1%蔗糖溶液与1瓶100 mL蒸馏水。60 min后将瓶取走测量，计算出大鼠糖水、纯水消耗及糖水偏爱百分比(糖水偏爱百分比=糖水消耗量／总液体消耗量×100％)。
(2) 旷场实验：在模型建立后，进行大鼠旷场实验。旷场由木板制作，大小为120 cm×90 cm×35 cm，内面用黑漆涂满，早上9：00—10：00在安静环境下进行实验。将大鼠放在旷场中心，同时采用动物行为自动跟踪系统记录大鼠10 min的行为活动，并观察记录大鼠10 min内直立次数。记录完成后使用动物行为自动跟踪系统分析。分析指标为总行程、平均速度、攀附次数。每次测试1只大鼠，测试完成后将场地清理干净，防止前一只大鼠留下的粪便、小便及气味影响后一只大鼠的行为活动。
3. 取材 实验结束之后，将动物麻醉后处死，分离出心脏，进一步分离出心室标本，将其迅速置于液氮中，并迅速放置于-70°冰箱中保存。
4. Western Blot检测心肌Bax及Bcl-2蛋白表达利用 BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白质定量，在550 nm波长处测定标准品吸光度OD550，以蛋白质浓度作为横坐标，OD550为纵坐标，绘制出标准曲线图，根据此图计算出样品的蛋白浓度。将相同量的上清液，约每孔40 μg 蛋白溶液体积，放于沸水浴中加热约5 min，从而使蛋白变性，冷却后放到离心机中以800 r离心3 min，之后取上样。再把凝胶放入缓冲液中15 min，把PVDF膜放入甲醇中15 s，之后再放入转膜缓冲液中15 min。按照正极—海绵—滤纸—PVDF膜—平衡胶—滤纸—海绵—负极顺序安装后放于电泳槽中，加缓冲液，转膜并脱色。使用 5%的脱脂奶粉封闭液在摇床上室温封闭 120 min，再用PBST洗膜2次。一抗孵育：使用封闭液以稀释一抗，之后再将一抗滴到蛋白膜上面，在室温下摇摆床上孵育60 min，之后放于4 ℃冰箱下孵育过夜。再用PBST洗膜3次，每次约20 min。二抗孵育：用TBST洗膜3次，每次10 min，再加入5%的封闭液以1∶2000配制的二抗(KPL，美国)，37 ℃孵育1 h后，TBST洗膜 3次，每次15 min。将ECL 超敏发光液混合后滴加到膜上，显影、定影。以β肌动蛋白作为内参，目的条带积分光密度(OD)值与内参积分OD值比较，得出相对OD 值为蛋白表达水平。
5. 统计学分析 所有数据以均数±标准差表示，采用SPSS 17.0软件进行数据分析，各实验组间资料比较采用单因素的方差分析，P<0.05有统计学意义。
三、实验结果
1. 动物模型 心梗组及模型组大鼠心梗前后心电图改变见图4-1，Masson染色见图4-2；最终动物模型组成为正常组8只、抑郁组8只、心梗组7只和模型组8只。
图4-1 大鼠心梗前后心电图改变
注：前半部分为结扎冠状动脉左前降支前心电图，后半部分为结扎冠状动脉左前降支后心电图。
图4-2 大鼠心梗前后Masson染色(×400倍)
注：(a)正常大鼠心肌纤维排列整齐、红染(Masson染色)；(b)心梗后大鼠心肌梗死区出现大量胶原纤维，排列紊乱、蓝染(Masson染色)。
2. 各组大鼠行为学比较 糖水消耗实验：与正常组相比，抑郁组、心梗组及模型组大鼠糖水偏爱百分比明显减少，差异具有显著性(P<0.05)；模型组较抑郁组减少，但差异不明显(P>0.05)；模型组较心梗阻明显减少，差异具有显著性(P<0.05)(表4-1)。
旷场实验：与正常组相比，抑郁组、心梗组及模型组大鼠旷场实验中总行程和直立次数均明显减少，运动速度明显降低，差异具有显著性(P<0.05)；模型组较抑郁组减低，差异不明显(P>0.05)；模型组大鼠总行程和运动速度较心梗组明显减少或降低，差异具有显著性(P<0.05)；而模型组直立次数较心梗阻减少，但差异不明显(P>0.05)(表4-1、图4-3)。
注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。
图4-3 各组大鼠行为学比较柱形图
注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。
3. 各组大鼠心肌Bax/Bcl-2值 与正常组相比，抑郁组、心梗组及模型组心肌Bax/Bcl-2值明显增高，差异具有显著性(P<0.05)；其中模型组比值最高；模型组较心梗组及抑郁组均明显增高，差异具有显著性(P<0.05)(表4-2、图4-4)。
注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。
图4-4 各组大鼠心肌Bax/Bcl-2值比较
注：(a)为心脏Bax、Bcl-2蛋白检测结果示意图；(b)为各组大鼠心肌Bax/Bcl-2值比较，与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。
四、讨论
研究表明心梗与抑郁为双向关系，抑郁在心梗患者中广泛而持续存在，且抑郁严重影响心梗患者预后，无心血管疾病的抑郁患者发生心梗的风险明显增高，但是目前心梗与抑郁的共病机制仍不清楚。本研究通过建立抑郁、心梗及心梗后抑郁大鼠模型探索抑郁是否可以加重心梗后心肌细胞凋亡及凋亡机制是否为心梗与抑郁共病机制。本研究结果显示心梗、抑郁及模型组大鼠糖水偏爱百分比，旷场实验总行程、直立次数较对照组均明显减少，运动速度明显降低，其中模型组大鼠减低最为明显；心梗、抑郁及模型组大鼠心脏Bax/Bcl-2值均明显高于正常组，模型组大鼠Bax/Bcl-2值较心梗组及抑郁组也明显增高。
糖水消耗实验评价大鼠快感缺乏，旷场实验评估大鼠在新环境中的启动、探究行为、紧张恐惧状态和对新环境的警觉性。本研究中抑郁组、心梗组及模型组大鼠这些行为学改变代表其对新环境的探索能力、兴奋程度及适应能力下降，与抑郁症典型的临床症状情感低落、好奇心和兴趣下降相似。因此，本研究表明心梗组大鼠行为学改变与抑郁大鼠组行为学改变相似，这可能与心梗后抑郁发生率增加有关。心梗后抑郁组大鼠行为学改变较心梗组及抑郁组大鼠改变更为显著，因此心梗与抑郁可以相互影响、相互加重。
细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序的死亡。许多因素可导致心肌细胞凋亡，包括缺氧、再灌注、心肌梗死等。细胞凋亡主要有两种途径，一种是外源性(死亡受体)途径，另一种为内源性(线粒体)途径。两种途径均参与心肌梗死后心肌细胞的凋亡，但内源性凋亡途径发挥着主要作用。线粒体外膜通透性(MOMP)增高导致细胞色素C及其他促凋亡蛋白释放是内源性凋亡途径中关键步骤。MOMP主要由Bcl-2家族中促凋亡成员Bax、Bak及抑制凋亡成员Bcl-2、Bcl-xl调节。Bax可诱导其他蛋白形成离子通道或自身形成离子通道，还可诱导脂质体结构改变形成通透性转运孔导致细胞色素C等释放，促进凋亡。生理pH条件下Bcl-2可阻止Bax在线粒体膜上形成通透性转运孔，抑制细胞色素C的释放，抑制细胞凋亡。Bax/Bcl-2值决定细胞凋亡的敏感性优于Bax或Bcl-2单个指标，Bax/Bcl-2值越高，凋亡越活跃，因此本实验使用Bax/Bcl-2值作为心肌细胞凋亡指标。本研究结果表明心梗组、抑郁组及模型组大鼠心肌细胞凋亡较正常组大鼠心肌细胞凋亡明显增加，模型组大鼠心肌细胞凋亡较心梗组和抑郁组大鼠也明显增加。因此，心梗与抑郁均可导致心肌细胞凋亡，抑郁可促进心梗后心肌细胞进一步凋亡，这可能是心梗后抑郁发生率增加、抑郁后心梗发生率增加及抑郁严重影响心梗预后的原因之一。Olivetti等研究发现急性心梗后心梗周边区有12%的心肌细胞发生凋亡，远离心梗区有1%的心肌细胞发生凋亡，这与本实验中心梗组大鼠心肌细胞凋亡明显增加结果一致。Wang等研究表明抑郁大鼠心脏促凋亡Bax mRNA表达增加，抑制凋亡Bcl-xl mRNA表达减少，这与本实验中抑郁组大鼠心肌细胞凋亡明显增加结果一致。此外本实验还发现抑郁可明显加重心梗后心肌细胞的凋亡，这可能与抑郁增加心梗后不良事件的发生有关。
抑郁大鼠不仅心肌细胞凋亡增加，Kosten等研究表明抑郁大鼠大脑边缘系统，尤其是海马神经元凋亡也增加，凋亡被认为是抑郁发生的机制之一。心梗后不仅心肌细胞凋亡增加，Kumar等研究表明心梗后大脑边缘系统，尤其是海马及杏仁核神经元凋亡也明显增加，心梗后抑郁行为学改变与大脑边缘系统神经元凋亡有关，心梗后抑郁发生率增高可能与心梗后大脑边缘系统神经元凋亡有关。抑郁可导致心肌细胞凋亡增加，并且可促使心梗后心肌细胞进一步凋亡，心肌细胞凋亡在心梗及扩张型心肌病及心室重塑的病理过程中发挥着重要的作用，这可能与抑郁后心梗发生率增高及抑郁严重影响心梗预后有关。心梗、抑郁后大脑与心肌具有相同的病理损害——细胞凋亡，而且心梗后抑郁大鼠心肌细胞及神经元凋亡较心梗及抑郁后明显增加。心梗与抑郁后细胞凋亡相互影响、相互促进，凋亡可能是心梗促发及加重抑郁的一个重要的病理生理机制，同时凋亡可能也是抑郁促发及加重心梗的一个重要的病理生理机制。因此，凋亡可能是心梗与抑郁的共病机制之一。此外，炎症因子、氧化应激在促进大脑与心肌细胞凋亡中发挥着重要作用，心梗和抑郁均可导致中枢和外周炎症反应加重，炎症因子增加，有研究表明心梗后不仅心脏及血浆中促炎症因子如TNF-α、IL-1β和IL-6增高，而且心梗后数分钟内大脑中促炎症因子TNF-α也增多并且可持续至少1个月。炎症因子可促进大脑及心肌细胞凋亡；此外心梗与抑郁均可致体内活性氧类(ROS)增高，ROS增加可激活线粒体凋亡途径，从而诱导细胞凋亡。
综上所述，心梗与抑郁均可导致心肌细胞凋亡，抑郁可促进心梗后心肌细胞进一步凋亡，这可能是心梗后抑郁发生率增加、抑郁后心梗发生率增加及抑郁严重影响心梗预后的原因之一。心梗、抑郁后大脑与心肌具有相同的病理损害细胞凋亡，而且心梗后抑郁大鼠心肌细胞及神经元凋亡较心梗及抑郁后明显增加，凋亡可能是心梗促发及加重抑郁的一个重要的病理生理机制，同时凋亡可能也是抑郁促发及加重心梗的一个重要的病理生理机制。凋亡可能是心梗与抑郁的共病机制之一。
五、结论
(1) 抑郁、心梗及心梗后抑郁大鼠的糖水偏爱百分比明显减少，其中心梗后抑郁大鼠最为明显。
(2) 抑郁、心梗及心梗后抑郁大鼠旷场实验中总行程和直立次数均明显减少，运动速度明显降低，其中心梗后抑郁大鼠减低得最为明显。
(3) 抑郁、心梗及心梗后抑郁大鼠心肌Bax/Bcl-2值明显增高，其中心梗后抑郁大鼠心肌Bax/Bcl-2值最高。
(4) 凋亡机制是心梗与抑郁的共病机制之一。
第二节 心肌梗死后抑郁大鼠海马中NMDAR1和Ca2+的变化及其机制
引言
精神及心理疾病在普通人群中相对比较常见，事实上，据估计全球疾病负担的14%都归因于心理障碍患者，这个数据可能偏低，因为其未能将心理健康与其他疾病的关系考虑其中。从常见的慢性疾病如心血管疾病中，人们越来越清楚地认识到抑郁症也会增加其死亡风险。对于心梗患者，较高的抑郁及焦虑评分被发现可以预测全因死亡率及心源性死亡率。在急性心梗患者中，焦虑及抑郁可以预测其死亡率，而抑郁症状在预测死亡率方面比焦虑症状更为稳定。
流行病学研究发现，冠心病患者中抑郁症(major depressive disorder，MDD)的发病率最高。抑郁是冠心病的独立危险因素，不仅降低了患者的生活质量，还使患者心血管事件的发病率及死亡率明显增加。抑郁症作为一种高发病率及致残率的精神疾病，其与室性心律失常(ventricular arrhythmia，VA)及心脏性猝死(sudden cardiac death，SCD)密切相关。冠心病合并抑郁患者，其体内血小板长期处于较高水平的活化状态，与抑郁相关的心血管疾病风险增加可能依赖于这种状态，长期抗抑郁药物治疗及心理治疗可以缓解冠心病合并抑郁患者的血小板活化状态。
心理因素如压力及应激等对冠心病发展及预后的影响已得到广泛研究，而更多的研究是关于抑郁与冠心病的关系。抑郁是普通冠心病患者疾病发生发展及预后的独立预测因子，65％ 的心梗患者有抑郁症状，其中20％在18个月内发展为严重的抑郁症，急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)患者出现抑郁的风险和正常健康人群相比明显增高。
心梗是威胁人类健康的重要疾病，而心梗患者在疾病的发展过程中，常合并焦虑、抑郁等不良情绪。Meta分析显示，心梗后抑郁的发生与疾病的预后密切相关，心梗合并抑郁患者的致命性及非致命性心血管事件的发生率均明显增加。因此早期识别及积极治疗心梗患者合并的抑郁症状可以明显改善患者的生存率及整体预后。
随着人们生活方式的改变及生活节奏的加快，心血管疾病的发病率明显增加，成为威胁人类健康的重要疾病。众所周知，高血压、高血脂、糖尿病、肥胖、吸烟等是心血管疾病共同的危险因素。目前，关于大脑神经系统的变化，特别是海马的变化及其与抑郁症的关系受到学者们的关注。
有研究显示冠心病合并抑郁症患者体内IL-6、C反应蛋白(CRP)和TNF-α的血液循环水平明显增高，与心肌组织相平行，脑组织中这些物质浓度也迅速升高，资料显示这些物质在心脏和大脑中存在着一定的病理生理联系。由此我们推测心梗后抑郁症的发生可能与大脑某些部位细胞因子的变化有关。
我们用实验大鼠制作心梗后抑郁模型，试图探讨心梗后抑郁大鼠神经系统(主要是海马)中与抑郁相关蛋白的变化情况及其发生机制，为全面深入了解心梗后抑郁的发生机制，寻求新的治疗方法，降低心梗合并抑郁患者的住院率及死亡率提供新的思路。
一、心梗后抑郁大鼠模型的制作及在体电生理研究
1. 材料
(1) 实验动物：清洁级(specific pathogen free，SPF)健康雄性SD(SpragueDawley)大鼠共48只(购买于武汉大学动物实验中心)，体重120~160 g。在SPF动物实验中心适应性饲养一周。利用随机数字量表将大鼠随机分为正常组(NCP)、心梗(MI)组、抑郁(MDD)组、心梗合并抑郁(MI+MDD)组，每组12只。
(2) 其他试剂与材料
①戊巴比妥钠 0.1 g/10 mL；培养皿 2个；
②注射用青霉素钠 80万U/支；小号圆针及三角针若干；
③生理盐水；非吸收性外科缝线(30)；
④小动物呼吸机；经纬恩线 50；
⑤手术照明灯；碘伏；
⑥大鼠固定板(固定线或橡皮筋5根)；针管(1 mL、2 mL、10 mL)；
⑦手术洞巾(2块)；无菌纱布若干；
⑧小动物开胸器；无菌棉球若干；
⑨大号弯剪；无菌胶布手套若干；
⑩持针器；5％GNS若干；
眼科剪(直剪及弯剪各1把)；电子秤等。
手术刀1把；
2. 方法
(1) 动物模型的制作
①大鼠心梗模型的制作：实验大鼠测量体重后，用预先配制好的1%的戊巴比妥钠(0.1 g/10 mL)进行腹腔注射(40 μg/kg)麻醉，大约10 min后用橡皮筋把处于麻醉状态的大鼠固定，然后用大号弯剪对大鼠颈部及左侧前胸部进行备皮，戴无菌手套，用浸润有碘伏的无菌棉球消毒颈部皮肤，用无影灯照射大鼠颈部声门部位，打开口腔可见开合的声门，用小动物气管插管针在直视下插管，插入气管约1 cm，打结固定后，连接小动物呼吸机(Harvard，USA)对大鼠进行辅助通气。调整呼吸机参数：潮气量4~5 mL/次，呼吸频率68~72次/分，定容模式，吸气∶呼气=1∶1。
用浸润有碘伏的无菌棉球消毒大鼠左侧前胸部皮肤，用右手食指及中指触摸大鼠心脏的搏动，可在左侧胸骨旁线第3、4肋间触及最明显的心脏搏动，连接心电图机，便于观察及记录大鼠手术前后心电图的变化情况。用手术刀沿心脏搏动最明显处纵行切开皮肤，切口长度为1.5~2.0 cm，然后用组织钳钝性分离胸大肌和前锯肌并将其固定，并向两边扩开第3、4肋，剪开第2、3肋间肌，钝性分离进胸，可见明显的心脏搏动，用镊子小心地撕开胸膜，注意避免损伤肺组织引起气胸。并用开胸器撑开胸廓，充分暴露视野，用镊子轻轻地撕开心包膜，观察心脏的颜色及搏动情况，待心脏搏动及胸廓活动正常后，充分暴露左心耳，寻找冠状动脉左前降支，其起始部位一般为左心耳根部与肺动脉圆锥交点下方3~4 mm处，用50带线小血管专用缝针进行永久性结扎，进针深度约1.5 mm，跨度可达2.5~4 mm。结扎后可以观察到与结扎前相比，心电图上ST段抬高，R波融合，同时在结扎周围区可以看到心肌的颜色变白，这也是结扎成功的标志。注意结扎部位避免偏高或偏低，结扎部位偏高会使大鼠心肌缺血范围过大，心肌坏死面积过多，导致死亡率增加；结扎部位偏低，只会使心肌轻微缺血，缺血周围的心肌仍可以得到血供，不足以引起心肌坏死，使造模失败。因此，每次结扎时尽量保持在同一位置。然后观察心脏搏动的频率及节律有无异常，并探查胸腔，观察有无活动性出血，并吸尽胸腔内积血。迅速用4-0无损伤带线缝针连续缝合胸廓，在结扎最后两结前，胸腔置入静脉留置管，在结扎最后一结前，抽吸胸腔内积液及积气。并依次缝合肌肉、皮肤。待大鼠麻醉清醒并恢复自主呼吸后可拔出气管插管，在白炽灯下复温1 h，放入笼内饲养并密切观察其术后活动及恢复情况。术后为预防伤口感染，需用青霉素钠80万U连续3天肌内注射。
②大鼠抑郁模型的建立：大鼠心梗模型建立7天后，给予慢性不可预见性温和应激(CUMS)刺激，制作心梗后抑郁模型。制作方法如下：将垫潮湿垫料24 h、鼠笼倾斜45 ℃ 24 h、行为限制2 h、禁食24 h、4 ℃冰水游泳5 min、禁水24 h、夹尾1 min、36 h持续光照这8种刺激随机安排到28天内，每天在不同的时间点给予不同的刺激，使其无法预知刺激的发生。
(2) 动物模型的评价
①大鼠心梗模型的评价
a.急性心梗大鼠存活率：在术后1.5~2 h可以观察到心梗模型大鼠开始恢复活动，12 h后可以观察到其进食，在饲养过程中可观察到其摄食及运动量减少，表明创伤对大鼠的行为产生了一定的影响。由于建立急性心梗模型的手术本身所致死亡率较高，且心梗后7天内仍处于急性期，仍是大鼠死亡的高风险期，因此，术后7天内死亡的大鼠不纳入观察指标。
b.心电图检查：心梗组大鼠结扎后可以观察到与结扎前相比，心电图上ST段抬高，R波融合，表示急性心梗模型制作成功。
②大鼠抑郁模型的评价
a.糖水消耗实验：在实验前对大鼠进行糖水适应性训练(第一天每只大鼠的笼子内放置两瓶1%的蔗糖水，第二天每只大鼠笼子内放置一瓶蒸馏水，一瓶1％蔗糖水)，连续2天内大鼠自由饮用两瓶液体。每天交换两个瓶子的位置，之后禁水24 h，第三天开始行糖水消耗实验，在同一时间将装有100 mL蒸馏水及100 mL 1%蔗糖水的瓶子放在每只大鼠笼内，测量大鼠1 h内蔗糖水摄取量和蒸馏水摄取量。大鼠糖水摄取量=糖水摄取体积/每100 g体重。
b.旷场实验：造模前及造模后28天对各组大鼠进行旷场实验，观察其行为学变化。旷场大小为120 cm×90 cm×35 cm，实验在早晨9：00-10：00进行。将实验大鼠放在旷场中，用动物行为跟踪系统(Ethovision 3.0)记录大鼠在旷场的活动情况，每只大鼠记录时间为10 min。研究者自行观察并记录大鼠在10 min内的爬行速度、攀壁次数、爬行距离等。每次测试一只大鼠，在下一只大鼠测试前将实验场所清理干净。
(3) 在体电生理研究
①单向动作电位(MAP)的记录：造模后的第28天，将大鼠称重后，用1%的戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，将大鼠固定于大鼠固定板上，连接心电监护，用小动物气管插管针在直视下行气管插管并连接小动物呼吸机，开胸将心脏充分暴露在视野下。把准备好的针形电极的两个尖端分别垂直放在大鼠左心室心外膜的梗死周边区及非梗死区，对于正常组大鼠，也将电极的两个尖端放在相同的部位，轻压电极的末端，使电极固定于左心室外膜。在靠近心脏部位的皮下放置参考电极，将金属针刺入模型大鼠的四肢皮下，同时记录大鼠的体表心电图(ECG)，走纸速度为100 mm/s。将针形电极的另一端与电生理记录仪(LEAD2000)连接，观察MAP的图形变化，待其图形稳定后，记录并储存波形于计算机硬盘中便于回放及分析。记录最大上升速率到复极化50%所需的时间即为MAPD50，其到复极化90%所需的时间记MAPD90，每只大鼠均计算3个心脏搏动的MAP并取平均值。
②室颤阈值和有效不应期(ERP)测定：用DF5A电生理刺激仪(购于苏州东方电子仪器厂)给予短阵高强度刺激，刺激的周长设为60 ms，脉宽为10 ms，每次刺激持续时间为30 s，间断1 min后给予下一次刺激。起搏初始电压设为4 V，每次加大1 V，把能引起室颤的最低刺激强度记录为室颤阈值。在测完室颤阈值后，进行程控刺激，S1S1=150 ms，S1S2=120 ms，以-10 ms进行反扫，脉宽设为2 ms，舒张期起搏阈值2倍设为刺激强度，给予8个连续的S1刺激后再给予期前刺激S2，直到期前刺激S2不能诱发相应QRS波群的S1S2最长时间间隔作为该点的ERP。
二、心梗后抑郁大鼠海马中细胞因子水平的变化
1. 实验动物
(1) 动物模型制作及评价：同第一部分。
(2) 大鼠海马组织标本的提取：实验大鼠电生理记录结束后立即用颈椎脱臼的方法离断大鼠头部，取出脑组织，分离出双侧海马组织，迅速将提取的组织用锡纸封存并放置液氮中冷藏，然后再将标本转移至-80°C冰箱冷藏待用。
2. 仪器及试剂 如表4-3和表4-4所示。
3. 试剂准备
(1) 缓冲液的配制
①转膜缓冲液2 L：甘氨酸 28.8 g、Tris 4.84 g、甲醇400 mL，加双蒸水至2000 mL。
②电泳缓冲液2 L：Tris 6.06 g、甘氨酸37.54 g、SDS 2 g，加双蒸水至2000 mL。
③TBS缓冲液 1 L：1 mol/L Tris-HCl(pH=7.50)；10 mL NaCl 8.8 g；加蒸馏水至1000 mL。
(2) 蛋白酶抑制剂的配制
①非磷酸化蛋白：每1 mL RIPA裂解液中加入20 μL 50×cocktail和10 μL 100 mM 的PMSF混匀。
②磷酸化蛋白：每1 mL RIPA裂解液中同时加入20 μL 50×cocktail、10 μL 100 mM的PMSF、10 μL磷酸化蛋白酶抑制剂A、10 μL酸酸化蛋白酶抑制剂B混匀。
4. 样品制备
(1) 海马组织中总蛋白的提取：用冷的TBS缓冲液把预先提取的海马组织标本洗涤2~3次，洗净海马组织上残留的污染物及血液，把清洗干净的海马组织用消毒后的组织剪迅速剪碎，然后把剪碎的海马组织放入匀浆器的球形部位，将约10倍海马组织体积的预冷匀浆缓冲液加入匀浆器中放在冰上进行匀浆(匀浆速度为1000 r/min，匀浆10~20次，每次5~10 s)，在使用前几分钟需添加蛋白酶抑制剂。一般匀浆30 min后，把裂解液用移液器转移到1.5 mL的离心管中，轻微晃动离心管。然后冰水浴30 min，为了让细胞得到完全裂解，可用移液管在冰水浴期间反复吹打细胞。冰水浴结束后，把装有标本的离心管放在离心机上离心5 min(转速为12000 r/min，温度为4 ℃)，离心完毕后收集到的上清液即为海马组织总蛋白提取溶液。然后用0.5 mL的离心管分装上清液，并放在-20 ℃的冰箱中保存待用。
(2) 细胞总蛋白质的提取：
①对于悬浮细胞：用离心的方法收集细胞，每106细胞中加入250 μL的RIPA裂解液，在使用前几分钟添加蛋白酶抑制剂，震荡混匀。如果需要提高蛋白质的浓度，可以适量减少RIPA裂解液的体积。
②对于贴壁细胞：倒掉培养皿中的培养液后，将培养皿倒扣在吸水纸上，吸干培养液后加入4 ℃的预冷TBS缓冲液3 mL，将培养皿平放在实验台上，轻轻摇动培养皿1 min，洗涤细胞，然后倒掉洗涤液。再重复上述操作两次，将细胞一共洗涤三次，便于洗净培养液，最后一次彻底地吸干残留液，然后把培养皿放在冰上。在培养皿中添加适当体积的 RIPA裂解液(在使用前几分钟添加蛋白酶抑制剂)并静置3~5 min。为了让试剂与细胞充分混合，可反复轻微震荡培养皿。等待裂解完成后，用细胞刮刀将细胞刮到培养皿的一侧，然后将试剂和裂解的细胞用移液管收集到1.5 mL的离心管中。然后冰水浴30 min，为了让细胞得到完全裂解，可用移液管在冰水浴期间反复吹打细胞。冰水浴结束后，将装有标本的离心管放在离心机上离心5 min(转速为12000 r/min，温度为4 ℃)，离心完毕后收集到的上清液即为细胞总蛋白提取溶液，然后用0.5 mL的离心管分装上清液，并放在-20 ℃的冰箱中保存待用。
5. 蛋白质浓度的测定
(1) 采用Bradford方法进行检测。
(2) 制作标准曲线。
(3) 用生理盐水把10 mg/mL的BSA稀释到1 mg/mL。
(4) 测定样品浓度。
(5) 把待测蛋白1 μL及0.9%生理盐水99 μL加入900 μL的Bradford中，充分混合均匀后检测在595 nm处的吸光值(表4-5)。根据标准品的浓度制作标准曲线，然后计算各样本的蛋白含量。
(6) 蛋白浓度测量完毕后，计算上样量为含40 μg蛋白溶液体积。
(7) 把蛋白质样品与5×蛋白上样缓冲液混合，沸水浴5 min。
6.SDS-PAGE电泳
(1) 清洗玻璃板。
(2) 灌胶与上样
①把两块玻璃板对齐后放入灌胶用的模具中夹紧，避免凝胶的渗漏。
②配制10%的分离胶，然后加入TEMED，轻轻摇晃使其混合均匀，用吸管将凝胶液小心地加入凝胶模具中。为了使凝胶表面平整，可在分离胶表面轻轻地覆盖一层水，等待45 min后如果看见分离胶与水层之间有一清楚的界面表示凝胶聚合，轻轻地倒掉分离胶上面的水，用吸水纸慢慢吸干残留的水。
③按同样的方法配制5%的浓缩胶，然后加入TEMED，轻轻摇晃使其混合均匀，用吸管把浓缩胶加在分离胶表面，使浓缩胶全部覆盖玻璃板，然后把梳子稍微倾斜插入浓缩胶中。
(3) 电泳：上样后连接电源进行电泳，将浓缩胶的电压调为75 V，分离胶的电压调为120 V，电泳30~40 min可终止电泳，将凝胶玻璃板从电泳槽中取出。
7. 转膜 准备大小合适的 PVDF膜1张，7 cm×9 cm的滤纸6张，在使用前用甲醇活化PVDF膜。在转膜用的容器中加入转移液，然后把转膜用滤纸、活化的PVDF膜、夹子、海绵垫(2块)、玻璃棒(1支)放入容器中。打开夹子，垫上海绵(1块)及滤纸(3层)。将分离胶轻轻地剥离，覆盖在滤纸上，然后把PVDF膜覆盖在凝胶上，并小心地清除PVDF膜与凝胶之间的气泡。在PVDF膜上再覆盖3层滤纸，排除PVDF膜与滤纸之间的气泡，然后在滤纸上面再覆盖一张海绵垫并开始转膜。转膜条件：200 mA，1 h。
8. 免疫反应 在室温条件下，用5%的脱脂牛奶(0.5%的TBST溶解后配制)将转好的膜在脱色摇床上封闭1 h。然后再稀释一抗(稀释比为1∶1000)，用5%的脱脂牛奶稀释非磷酸化的目的蛋白，用TBST溶解的5%的BSA溶液稀释磷酸化蛋白，并放在4 ℃冰箱中过夜。第二天在室温条件下，用TBST在脱色摇床上把一抗洗涤三次，每次洗涤时间为5 min。然后用TBST把二抗按同样的方法稀释3000倍，在室温条件下孵育30 min后，用TBST将二抗在室温条件下脱色，然后放在摇床上洗涤3次，每次洗涤时间为5 min。
9. 化学发光 用离心管将前面的两种试剂均匀地等体积混合，为了能够与混合液充分地混合均匀，需要将膜蛋白面朝向上方，经过1~2 min，将残留液去除干净，包好后放进暗匣中进行曝光。曝光结束后用显影、定影试剂进行显影和定影。根据光强度的不同来调整曝光时间。
10. 凝胶图像分析 将胶片扫描存档，用Alpha软件处理系统来分析目标带的光密度值。
三、结果
1. 统计学处理 用SPSS 18.0软件对数据进行分析，分析结果用均数±标准差表示。两组间比较使用独立样本的t检验，多组间比较使用单因素方差分析，P<0.05则差异有统计学意义。
2. 动物模型的行为学评价
(1) 心梗模型评价：本次心梗模型的成功率约为66.7%(8/12)。对大鼠冠状动脉左前降支手术区进行结扎后，对手术前后的体表心电图进行观察比较(图4-5)。
图4-5 心梗模型大鼠在手术前后心电图变化
从图4-5可以看出手术后大鼠的心电图发生了明显变化，可见ST段抬高与R波融合。上述结果表明结扎大鼠冠状动脉左前降支后，导致大鼠心肌急性缺血，如果缺血长时间得不到改善，即可造成结扎周围部位的心肌坏死，这是我们结扎大鼠冠状动脉左前降支制作急性心梗模型的理论基础。同时在结扎后，可见结扎周围区的心肌颜色变白，这也是结扎成功的标志。结扎部位过高或过低都会对实验结果产生影响，结扎部位过高会导致大鼠心肌缺血严重，坏死面积过大，死亡率增加；结扎部位过低，会导致心肌小部分缺血，不足以达到引起心肌坏死的程度，使造模失败。
(2) 抑郁模型评价：在造模后28天对大鼠进行糖水消耗实验及旷场实验，评价抑郁模型是否制作成功。结果显示(表4-8)：与正常组大鼠比较，心梗组、抑郁组及心梗合并抑郁组大鼠的攀壁次数(P=0.000)明显减少，爬行距离(P=0.000)均明显缩短，爬行速度明显降低(P=0.000)，糖水偏爱百分比也明显降低(心梗组P=0.009)，差异具有统计学意义(P<0.05)。与心梗组相比，抑郁组的攀壁次数未见明显减少(P=0.582)，爬行距离(P=0.14)、爬行速度(P=0.17)也未见明显差异，但糖水偏爱百分比降低(P=0.001)，差异具有显著统计学意义(P<0.01)；心梗合并抑郁组大鼠的攀壁次数(P=0.275)、爬行速度(P=0.071)未见明显差异，但爬行距离可见显著差异(P=0.009)，糖水偏爱百分比也可见显著差异(P=0.000)。与抑郁组大鼠相比，心梗合并抑郁组大鼠的攀壁次数(P=0.106)、爬行距离(P=0.212)、爬行速度(P=0.642)、糖水偏爱百分比(P=0.119)均未见明显差异。从本实验的研究结果中可以看出，与正常组的大鼠相比，心梗组、抑郁组及心梗合并抑郁组的大鼠的活动量明显降低，蔗糖水摄取量也明显降低，表现出消极的情绪与行为，说明手术创伤及慢性压力刺激都会对大鼠的行为产生一定的影响。但是与抑郁组大鼠相比，心梗组大鼠的旷场实验结果并没有表现出明显的差异，说明心梗后的大鼠也表现出抑郁样行为，也就是说心梗后大鼠常常会合并抑郁症状。与心梗组大鼠相比，心梗合并抑郁组大鼠的爬行距离及糖水偏爱百分比可见明显差异，说明抑郁可以使心梗大鼠的症状加重。本实验结果显示，急性心肌缺血及长期的慢性压力刺激都会使大鼠产生抑郁症状，而抑郁症状又会进一步使大鼠的抑郁样行为恶化。
注：与心梗组相比，★★P<0.01。
3. 在体电生理研究结果 在造模后28天，对各组大鼠进行电生理研究，观察指标为MAPD50、MAPD90、ERP及室颤阈值。结果显示(表4-9)：与正常组相比，心梗组大鼠的MAPD50(P=0.017)、MAPD90(P=0.000)、ERP(P=0.000)时间明显延长，且室颤阈值明显降低(P=0.000)，差异显著，具有统计学意义(P<0.05)；抑郁组大鼠的MAPD90(P=0.025)、ERP(P=0.000)时间明显延长，且室颤阈值明显降低(P=0.000)，差异具有统计学意义(P<0.05)；心梗合并抑郁组大鼠的MAPD90(P=0.000)、ERP(P=0.000)时间明显延长，且室颤阈值明显降低(P=0.000)，差异具有统计学意义(P<0.05)。与心梗组大鼠相比，抑郁组大鼠的室颤阈值明显降低(P=0.011)，差异具有统计学意义(P<0.05)，但两组间ERP差异不显著，并未见明显统计学意义(P=0.333)；心梗合并抑郁组大鼠的MAPD90(P=0.000)、ERP(P=0.000)时间明显延长，且室颤阈值明显降低(P=0.011)，差异具有统计学意义(P<0.05)。与抑郁组大鼠相比，心梗合并抑郁组大鼠MAPD50(P=0.006)、MAPD90(P=0.000)、ERP(P=0.000)时间明显延长，差异具有统计学意义(P<0.05)，但室颤阈值间未见明显差异(P=1.000)。
本实验结果显示，与正常组相比，心梗组、抑郁组及心梗合并抑郁组大鼠的单向动作电位及有效不应期时间明显延长，室颤阈值明显降低，说明心梗及抑郁大鼠的心脏电活动都处于不稳定状态，更容易发生心律失常；而与正常组大鼠相比，抑郁组大鼠的室颤阈值降低，单向动作电位时程延长，说明抑郁大鼠发生心律失常的风险增加；与心梗组相比，心梗合并抑郁组大鼠的单向动作电位及有效不应期时间延长得更加明显，且室颤阈值降得更低，说明抑郁可以使心梗大鼠发生心律失常的风险明显增加。
注：与心梗组相比，★P<0.05，★★P<0.01；与抑郁组相比，▲▲P<0.01。
4. 海马组织中各种细胞因子水平的变化 用Western Blot方法测量各组大鼠海马中Ca2+、NMDAR1水平的变化，见图4-6，结果分析见表4-10及图4-7。
图4-6 大鼠海马组织Western Blot结果(灰)
注：MDD，抑郁组；MI+MDD，心梗合并抑郁组；MI，心梗组；N，正常组。
注：与心梗组相比，★★P<0.01；与抑郁组相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。
图4-7 大鼠海马组织Western Blot结果条形图
注：★★与心梗组相比，P<0.01；▲与抑郁组相比，P<0.05；▲▲与抑郁组相比，P<0.01。
与正常组相比，心梗组、抑郁组及心梗合并抑郁组大鼠海马中Ca2+及NMDAR1的表达量明显增加(P=0.000)，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。
与心梗组相比，抑郁组及心梗合并抑郁组大鼠海马中Ca2+及NMDAR1的表达量明显增加(P=0.000)，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。
与抑郁组大鼠相比，心梗合并抑郁组大鼠海马中Ca2+(P=0.04)及NMDAR1(P=0.000)的表达量明显增加。
本实验结果显示，与心梗组相比，抑郁组大鼠海马中与抑郁相关蛋白NMDAR1及Ca2+的表达量明显增加。与抑郁组大鼠相比，心梗合并抑郁组大鼠海马中NMDAR1及Ca2+的表达量明显增加，我们推测可能与心梗后的慢性压力刺激引起海马神经元凋亡有关。
四、讨论
在冠心病患者中，抑郁症更为普遍，但是目前仍没有一个具体的模型可以解释抑郁症与冠心病的因果关系。抑郁增加冠心病患者并发症的可能机制包括行为学机制、遗传机制、免疫调节失调、凝血异常、血管内皮功能障碍、多不饱和ω-3游离脂肪酸缺乏、自主神经调节紊乱等。这些调节机制形成一个网络系统，连接着抑郁症与冠心病。心血管疾病患者，特别是急性心梗患者，因为疾病本身引起疼痛不适，常合并焦虑及恐惧情绪。而长期的药物治疗及对疾病预后的担忧，使心梗患者常合并抑郁症状，最终发展为抑郁症。本实验结果也显示，与正常组大鼠相比，心梗组大鼠在旷场实验中攀壁次数明显减少，爬行距离明显缩短，爬行速度也明显降低，表现为活动量减少的抑郁样行为，糖水摄取量也明显降低，表现为快感缺乏。而抑郁组大鼠的实验电生理结果显示，与正常组大鼠相比，其单向动作电位时程明显延长，室颤阈值明显降低，表现为心电活动处于不稳定状态，容易发生室性心律失常，心脏性猝死的风险也明显增加。与心梗组大鼠相比，心梗合并抑郁组大鼠的爬行距离缩短得更明显，糖水摄取量也更低，且其单向动作电位及有效不应期延长得更明显，室颤阈值也降低得更厉害，其更容易发生心律失常，心脏性猝死的风险也更高。
当创伤、压力刺激作用于机体时，下丘脑垂体肾上腺轴(HPA轴)兴奋，肾上腺皮质分泌的应激激素糖皮质激素升高。若机体长期处于压力状态，HPA轴持续亢进，可导致高皮质醇血症。持续的高皮质醇血症可导致海马神经元萎缩、退化及丢失，最终出现一系列的行为学效应，如记忆、认知和行为的改变，这可能是抑郁症患者出现临床表现的原因之一。海马是介导应激反应及应激激素作用的主要靶区，许多研究证实，应激可引起海马结构及功能的改变，而海马的损害在长期慢性压力应激时的高皮质醇血症中起重要作用，HPA 轴的负反馈调节被抑制而长期处于活跃状态，加重了海马神经元的损伤，造成了海马萎缩。在本次实验研究中，我们用Western Blot方法检测心梗后抑郁大鼠海马中与抑郁相关蛋白NMDAR1水平的变化，探讨心梗后抑郁大鼠海马的变化及其可能机制。
NMDAR1在调节Ca2+内流、触发细胞内活动、参与基因表达及突触强化中扮演着重要角色。心肌和海马中都存在NMDAR1，而且NMDAR1的激活与抑郁症密切相关。研究发现NMDAR1激活可以导致心肌细胞内Ca2+浓度升高，活性氧增多，Bax表达增多，Bcl-2表达减少，心肌细胞凋亡。NMDAR1具有调节Ca2+门控通道特性，可以引起细胞毒性反应。谷氨酸能神经系统活性的增加与NMDAR1激活程度及抑郁情绪有关。在慢性应激及压力刺激时，谷氨酸产生的迟发性神经元损伤主要由NMDAR1介导。NMDAR1触发的钙释放依赖于细胞内的Ca2+，NMDAR1在星形胶质细胞膜表达，它的激活引起细胞内Ca2+的表达，使胶质细胞产生兴奋，并可以引起Ca2+内流，使胞质内Ca2+浓度增加，当胞质内Ca2+浓度足够高时，可以触发钙通道开放，胞外Ca2+大量内流引起细胞内钙超载，是细胞死亡的主要原因，是多种因素引起神经元结构和功能损害甚至死亡的“最后共同通路”。IL-1β能促进NMDAR1和谷氨酸诱导的神经元死亡，原因可能为海马神经元中IL-1β通过激活Src家族酪氨酸蛋白激酶(Src family protein tyrosine kinases，Src PTKs)增加NMDAR1介导的Ca2+内流，使细胞内钙超载，产生大量氧自由基毒害细胞，引起DNA链断裂，使细胞坏死或凋亡，神经元大量丢失。本实验的结果显示，正常组大鼠海马中有少量NMDAR1表达，心梗组、抑郁组及心梗合并抑郁组大鼠的海马中NMDAR1的表达量明显高于正常组，说明创伤及神经元的损伤可以引起NMDAR1表达量的变化。且与正常组相比，心梗组、抑郁组、心梗合并抑郁组大鼠海马中Ca2+表达量也明显增加。结果表明，心肌缺血及慢性压力刺激可以使NMDAR1的表达量增加，其与谷氨酸结合的量也随之增加，进一步激活细胞内的Ca2+，通过NMDAR1-Ca2+通路介导神经元的凋亡。
抑郁症是不同程度的心理、生理、认知、神经内分泌、行为及社会功能障碍综合征，心理、社会及生物学因素共同影响着其症状的表现。创伤及慢性应激对神经生物学的影响是抑郁症发生的病理生理学一部分。重症抑郁症患者会伴随着大脑结构的改变，并常合并心血管疾病。大脑与心肌功能障碍之间可能存在共同的病理生理途径，我们推测可能是影响着与细胞凋亡有关的蛋白。我们推测心梗后抑郁症的发生与NMDAR1-Ca2+介导的细胞死亡有关，急性心肌缺血及慢性压力刺激都可以导致海马中NMDAR1表达量的增加，进一步激活钙通道，从而促发神经元的死亡。
谷氨酸能神经元信号的增强可以导致NMDAR介导的细胞内Ca2+浓度升高，细胞内Ca2+浓度升高进一步激活许多细胞激酶并调节其级联反应。在生理情况下，当兴奋性氨基酸——谷氨酸释放时，伴随着NMDAR和cAMP受体的活化，引起Ca2+内流，第二信使激活，导致包括长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD)在内的一系列级联反应，同时Ca2+的重摄取和缓冲进程也被激活。在病理情况下，谷氨酸堆积，NMDAR过度激活导致Ca2+内流，Ca2+不能被迅速有效地清除或者转运至细胞内钙库，导致级联反应增强，引起神经元坏死及凋亡。我们猜想，对于心梗合并抑郁患者，给予NMDAR1拮抗剂有可能逆转神经元的凋亡，改善心梗合并抑郁患者的精神症状，提高整体预后。
五、结论
(1) 心梗与抑郁互为因果关系。
(2) 心梗后的大鼠表现出抑郁样行为。
(3) 抑郁组大鼠的室颤阈值降低，心律失常及心脏性猝死的风险增加。
(4) 抑郁增加了心梗大鼠心律失常及猝死的风险。
(5) 心梗大鼠海马中NMDAR1及Ca2+表达量增加，这可能是心梗大鼠表现出抑郁样行为的机制之一。
(6)心梗合并抑郁大鼠海马中NMDAR1及Ca2+表达量明显增加，据此我们推测心肌缺血及慢性压力刺激可以通过NMDAR1-Ca2+ 通路介导神经元的凋亡。
参考文献
［1］Thombs B D，Bass E B，Ford D E，et al.Prevalence of depression in survivors of acute myocardial infarction［J］.J Gen Intern Med，2006，21(1)：30-38.
［2］Meijer A，Conradi H J，Bos E H，et al.Prognostic association of depression following myocardial infarction with mortality and cardiovascular events：a metaanalysis of 25 years of research［J］.Gen Hosp Psychiatry，2011，33(3)：203-216.
［3］Larsen K K，Christensen B，Sondergaard J，et al.Depressive symptoms and risk of new cardiovascular events or death in patients with myocardial infarction：a population-based longitudinal study examining health behaviors and health care interventions［J］.PLoS One，2013，8(9)：e74393.
［4］Saran R K，Puri A，Agarwal M.Depression and the heart［J］.Indian Heart J，2012，64(4)：397-401.
［5］Nicholson A，Kuper H，Hemingway H.Depression as an aetiologic and prognostic factor in coronary heart disease：a metaanalysis of 6362 events among 146 538 participants in 54 observational studies［J］.Eur Heart J，2006，27(23)：2763-2774.
［6］Possel P，Mitchell A M，Ronkainen K，et al.Do depressive symptoms predict the incidence of myocardial infarction independent of hopelessness?［J］.J Health Psychol，2013,20(1):60-68.
［7］Jarskog L F，Selinger E S，Lieberman J A，et al.Apoptotic proteins in the temporal cortex in schizophrenia：high Bax/Bcl-2 ratio without caspase3 activation［J］.Am J Psychiatry，2004，161(1)：109-115.
［8］Bisagno，V，Grillo C A,Pirali G G,et al.Chronic stress alters amphetamine effects on behavior and synaptophysin levels in female rats［J］.Pharmacol Biochem Behav，2004,78(3)：541-550.
［9］Kang P M，Haunstetter A，Aoki H，et al.Morphological and molecular characterization of adult cardiomyocyte apoptosis during hypoxia and reoxygenation［J］.Circ Res，2000，87(2)：118-125.
［10］Olivetti G，Quaini F，Sala R，et al.Acute myocardial infarction in humans is associated with activation of programmed myocyte cell death in the surviving portion of the heart［J］.J Mol Cell Cardiol，1996，28(9)：2005-2016.
［11］Danial N N，Korsmeyer S J.Cell death：critical control points［J］.Cell，2004，116(2)：205-219.
［12］Crow M T，Mani K，Nam Y J，et al.The mitochondrial death pathway and cardiac myocyte apoptosis［J］.Circ Res，2004，95(10)：957-970.
［13］Tait S W，Green D R.Mitochondria and cell death：outer membrane permeabilization and beyond［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2010，11(9)：621-632.
［14］Antonsson B，Conti F，Ciavatta A，et al.Inhibition of Bax channelforming activity by Bcl-2［J］.Science，1997，277(5324)：370-372.
［15］Chen Z，Chua C C，Ho Y S，et al.Overexpression of Bcl-2 attenuates apoptosis and protects against myocardial I/R injury in transgenic mice［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001，280(5)：H2313-2320.
［16］Wang Y，Xiao Z，Liu X，et al.Venlafaxine modulates depressioninduced behaviour and the expression of Bax mRNA and Bcl-xl mRNA in both hippocampus and myocardium［J］.Hum Psychopharmacol，2011，26(2)：95-101.
［17］Kosten，T A，Galloway M P,Duman R S,et al.Repeated unpredictable stress and antidepressants differentially regulate expression of the bcl-2 family of apoptotic genes in rat cortical，hippocampal，and limbic brain structures［J］.Neuropsychopharmacology，2008,33(7)：1545-1558.
［18］Jiao J，Huang X,FeitLeithman R A,et al.Bcl-2 enhances Ca(2+)signaling to support the intrinsic regenerative capacity of CNS axons［J］.EMBO J，2005,24(5)：1068-1078.
［19］Kubera，M，Obuchowicz E,Goehler L,et al.In animal models，psychosocial stressinduced(neuro)inflammation，apoptosis and reduced neurogenesis are associated to the onset of depression.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2011,35(3)：744-759.
［20］Wann B P，Boucher M，Kaloustian S，et al.Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat［J］.Biol Psychiatry，2006，59(5)：430-433.
［21］Wann B P，Bah T M,Kaloustian S,et al.Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction：effects of sertraline［J］.J Psychopharmacol，2009,23(4)：451-459.
［22］Kumar D,Jugdutt B I.Apoptosis and oxidants in the heart［J］.J Lab Clin Med，2003,142(5)：288-297.
［23］Ho Y L，Chen C L,Hsu R B,et al.The correlation between expression of apoptosisrelated proteins and myocardial functional reserve evaluated by dobutamine stress echocardiography in patients with dilated cardiomyopathy［J］.J Am Soc Echocardiogr，2003,16(9)：931-936.
［24］Dixon J A,Spinale F G.Pathophysiology of myocardial injury and remodeling：implications for molecular imaging［J］.J Nucl Med，2010,51 Suppl 1：102S-106S.
［25］Francis J,Zhang Z H,Weiss R M，et al.Neural regulation of the proinflammatory cytokine response to acute myocardial infarction［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004,287(2)：H791-797.
［26］Halaris A.Inflammation，heart disease，and depression［J］.Curr Psychiatry Rep，2013,15(10)：400.
［27］Francis J，Chu Y，Johnson A K，et al.Acute myocardial infarction induces hypothalamic cytokine synthesis［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，286(6)：H2264-2271.
［28］Yang J，Wang J,Zhu S,et al.C-reactive protein augments hypoxiainduced apoptosis through mitochondrion-dependent pathway in cardiac myocytes［J］.Mol Cell Biochem，2008,310(12)：215-226.
［29］Wann B P，Bah T M,Boucher M,et al.Vulnerability for apoptosis in the limbic system after myocardial infarction in rats：a possible model for human postinfarct major depression［J］.J Psychiatry Neurosci，2007,32(1)：11-16.
［30］Szuster-Ciesielska A，Stotwińska M,Stachura A,et al.Accelerated apoptosis of blood leukocytes and oxidative stress in blood of patients with major depression［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2008,32(3)：686-694.
［31］Charlson F J，Moran A E，Freedman G，et al.The contribution of major depression to the global burden of ischemic heart disease：a comparative risk assessment［J］.BMC Med，2013，11：250.
［32］Phillips A C，Batty G D，Gale C R，et al.Generalized anxiety disorder，major depressive disorder，and their comorbidity as predictors of all-cause and cardiovascular mortality：theVietnam experience study［J］.Psychosom Med，2009，71(4)：395-403.
［33］Nakamura S，Kato K，Yoshida A，et al.Prognostic value of depression，anxiety，and anger in hospitalized cardiovascular disease patients for predicting adverse cardiac outcomes［J］.Am J Cardiol，2013，111(10)：1432-1436.
［34］D’Audiffret A C，Frisbee S J，Stapleton P A，et al.Depressive behavior and vascular dysfunction：a link between clinical depression and vascular disease?［J］.J Appl Physiol(1985)，2010，108(5)：1041-1051.
［35］Meijer A，Conradi H J，Bos E H，et al.Prognostic association of depression following myocardial infarction with mortality and cardiovascular events：a metaanalysis of 25 years of research［J］.Gen Hosp Psychiatry，2011，33(3)：203216.
［36］Watkins L L，Koch G G，Sherwood A，et al.Association of anxiety and depression with all-cause mortality in individuals with coronary heart disease［J］.J Am Heart Assoc，2013，2(2)：e68.
［37］Meijer A，Conradi H J，Bos E H，et al.Adjusted prognostic association of depression following myocardial infarction with mortality and cardiovascular events：individual patient data metaanalysis［J］.Br J Psychiatry，2013，203(2)：90-102.
［38］Taylor W D，McQuoid D R，Payne M E，et al.Hippocampus atrophy and the longitudinal course of late-life depression［J］.Am J Geriatr Psychiatry，2014,22(12):1504-1512.
［39］Duman R S，Li N.A neurotrophic hypothesis of depression：role of synaptogenesis in the actions of NMDA receptor antagonists［J］.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2012，367(1601)：2475-2484.
［40］Parashar S，Vaccarino V.Depression and CHD risk：how should we intervene?［J］.Curr Treat Options Cardiovasc Med，2007，9(4)：272-277.
［41］Anghelescu I.Omega-3 fatty acids for CHD with depression［J］.JAMA，2010，303(9)：836.
［42］Bland P.Depression with CHD triples risk of death［J］.Practitioner，2010，254(1734)：5.
［43］Thurston R C，Kubzansky L D，Kawachi I，et al.Do depression and anxiety mediate the link between educational attainment and CHD?［J］.Psychosom Med，2006，68(1)：25-32.
［44］Wang X，Huang Y，Wang F，et al.Association of NMDAR，NR2A，and NR2B with cognitive impairment in diabetic patients［J］.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2013，33(12)：1848-1851.
［45］Marsden W N.Stressor-induced NMDAR dysfunction as a unifying hypothesis for the aetiology，pathogenesis and comorbidity of clinical depression［J］.Med Hypotheses，2011，77(4)：508-528.
［46］Chen H B，Li F，Wu S，et al.Hippocampus quinolinic acid modulates glutamate and NMDAR/mGluR1 in chronic unpredictable mild stressinduced depression［J］.Sheng Li Xue Bao，2013，65(6)：577-585.
［47］Sim S E，Lee H R，Kim J I，et al.Elevated RalA activity in the hippocampus of PI3Kγ knock-out mice lacking NMDAR-dependent long-term depression［J］.BMB Rep，2013，46(2)：103-106.
［48］Najjar S，Pearlman D，Devinsky O，et al.Neuropsychiatric autoimmune encephalitis without VGKC-complex，NMDAR，and GAD autoantibodies：case report and literature review［J］.Cogn Behav Neurol，2013，26(1)：36-49.
［49］Brendt P，Frey U，Adamzik M，et al.Darbepoetin alpha，a long-acting erythropoeitin derivate，does not alter LPS evoked myocardial depression and gene expression of Bax，Bc-lXs，Bcl-XL，Bcl-2，and TNF-alpha［J］.Shock，2009，31(1)：5054.
